1.ﾌﾟﾗｲﾏｰのデザインは、以下の項目を参考にして下さい。

• 良好なアニーリングのため、最低１８ｂｐは、必要です。１８〜２４ｂｐ Ｂｅｓｔ
• 同じ塩基が続かないようにします（特にＧ）。４塩基以上のＧは避けます。
• ＧＣ含量は、３０ー８０％（５０ー５５％が好ましい）となるようにします。（６８％以上rich）
• ﾌﾟﾗｲﾏｰのＴｍ値は、４５℃以上となるように。
• ﾌﾟﾗｲﾏｰダイマー、分子内構造を取るような、配列は避けます。

２ テンペレート濃度は、分光光度計やｱｶﾞﾛｰｽｹﾞﾙ電気泳動などで、確認します。
（完全な、定量はできないので、シーケンス後、蛍光強度が、低い場合は、テンペレートを増やすと上手く行く事もある。）

• 少ない場合：シーケンス反応が全く出ない、または、シグナルが弱い
• 多い場合：シーケンスが途中から、減衰する（繰り返しの配列がある場合も減衰します）。

  多めの方が、何かは読めます。

テンプレート溶解時の注意
ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒ使用時、EDTAが、反応液中のﾏｸﾞﾈｼｳﾑion濃度に影響を与えます。極力、ミリＱがｇｏｏｄ（ＥＤＴＡ使用時、濃度0.1mM以下がｇｏｏｄ）

３試薬の凍結溶解は、１０回以内にする、（使用に応じて、分注しておく）

• 試薬を希釈する場合には５ＸSequencing Ｂｕｆｆｅｒ（P/N4305605）を使用すると、経済的です。

ﾌﾟﾗｲﾏｰのTm値によってｱﾆｰﾘﾝｸﾞ温度を変更します。
Tm（℃）=２℃Ｘ（Ａ＋Ｔ）＋４℃Ｘ（Ｇ＋Ｃ）

• −Tm値＜５０℃：アニーリング時間を３０秒、あるいは温度を４８℃にします。
• −Tm値＞６０℃：アニーリングステップを省くことができます。

Tmを計算するサイト

難しいテンプレートの反応条件について

難しいテンプレートをシーケンスする場合には、以下の条件を御参考ください。

ＧＣ-richテンプレートの場合

• ｻｲｸﾙ前に９８℃５分の熱変性を行う
• ｻｲｸﾙ中の熱変性温度を９８℃に変更
• ＤＭＳＯなどの変性剤を終濃度５ー１０％となるよう添加

ＧＴ−richテンプレートの場合

• 伸長反応温度を５０〜５５℃に下げる。
• 反応液中に1mM MgCl2を添加する。
• ｄＧＴＰ Ｂｉｇ Ｄｙｅ Terminator ＫＩＴを使用する。
• ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＫＩＴを使用する。
• ＤＹＥnamic ＥＴ Terminator ＫＩＴを使用する。（ｱﾏｼｬﾑ社製）

さらに詳しい資料は、下より、ダウンロードして下さい。