dnasequse

＜ご自分で操作できる方向け＞
知っておくと便利な機能

プレートマネージャのインポート機能
データコレクションソフトウェアのプレートマネージャでのサンプルシート作成は
サンプル数が多いときは非常に時間がかかり面倒です。
インポート機能を使うと事前に用意したファイルを読み込ますだけで
サンプルシート作成が完了します。
教室で作成したファイルを読み込ます場合は、必ずメディアのウイルスチェックをして下さい。

用意するもの
Microsoft Excel（編集する場所が解ればメモ帳でも可能）
インポート用テンプレートファイル（テキストファイル）
　　BigDye v1.1用
　　 BigDye v3.1用
 操作手順書（PDF）

旧機種（POP6システム）用テンプレートファイル
　　BigDye v1.1用
　　BigDye v3.1用

使い方
上の操作手順書とご自分の使用しているBigDye用のテンプレートファイルを
ダウンロードします。（右クリックで「対象をファイルに保存」して下さい。）
操作手順書に従い、Excelを使ってテンプレートファイルを書き換えてください。
後はプレートマネージャで作成したファイルを読み込ますだけです。

アナリシスソフトウェアでの再解析
配列の読み始めがおかしい場合
アナリシスソフトウェアを起動し、サンプルファイルを開きます。
再解析したいサンプルのShow欄をチェックします。
再解析したいサンプルのBC欄をチェックします。
表示をRAWに切り替えます。
幅をDefault Sizeにします。
シーケンスが出始める少し前のポイントをクリックし、座標を読みとる。
読みとった座標をPeak1とStartに入力する。
スタートを押すと再解析を始めます。

BigDyeの設定を間違って泳動した場合
~~この方法を使うと問題なく配列を読むことができますが、あくまでも非公式なやり方ですので注意してください。~~
ABIのサポートに追加されていました。
アナリシスソフトウェアを起動し、サンプルファイルを開きます。
再解析したいサンプルのBC欄をチェックします。
DyeSet/Primerの欄が
KB_3130_POP7_BDTv1.mobの時はKB_3130_POP7_BDTv3.mobに
KB_3130_POP7_BDTv3.mobの時はKB_3130_POP7_BDTv1.mobにする。
スタートを押すと再解析を始めます。
ファイルを閉じるとき、保存を聞いてくるので結果が良ければ保存してください。

解析されなかった短いDNAサンプルを再解析する場合（POP7システム用）
この方法でも解析不能の場合がありますので、共同実験室では200base以下のシーケンスは
泳動不可の扱いにしています。泳動する場合は自己責任でお願いします。
アナリシスソフトウェアを起動し、サンプルファイルを開きます。
再解析したいサンプルのShow欄をチェックします。
再解析したいサンプルのBC欄をチェックします。
表示をRAWに切り替えます。
幅をDefault Sizeにします。
シーケンスが出終わった少し後のポイントをクリックし、座標を読みとる。
読みとった座標をStopに入力する。
スタートを押すと再解析を始めます。
（StartからStopまでの間隔が短いと設定値が勝手に変わることがあります。
その場合は解析不能です。諦めて下さい。）
ファイルを閉じるとき、保存を聞いてくるので結果が良ければ保存してください。

解析されなかった短いDNAサンプルを再解析する場合（POP6システム用）
上記POP7システム用と同じ方法も使えますが、POP6では
ベースコーラーを変更することも可能です。以下がその方法です。
アナリシスソフトウェアを起動し、サンプルファイルを開きます。
再解析したいサンプルのBC欄をチェックします。
BaseCaller欄をBasecaller-3130POP6SR.bcpに変更します。
DyeSet/Primerの欄を
BigDye v1.1の時はDT_3130POP6{BD}v2.mobに
BigDye v3.1の時はDT_3130POP6{BDv3}v1.mobにする。
スタートを押すと再解析を始めます。
ファイルを閉じるとき、保存を聞いてくるので結果が良ければ保存してください。
この方法はKBベースコーラーと違い、シグナルがなくても無理矢理塩基を読みとろうとします。
使用するときはシグナルが十分出ていることを確認して使用してください。

反応キットについて
BigDyeの希釈
ABI Quick Reference GuideではBigDyeは8ulを使用することになっていますが、
実際に8ul使うと濃いすぎる場合がほとんどです。
この場合、BigDyeを希釈して節約することができます。
希釈にはBigDye購入時に付いてくる5x Sequenceing Bufferを使います。
希釈の割合は以下のようになります。

BigDye   5xBuffer
8ul         0ul
4ul         2ul
2ul         3ul
1ul         3.5ul
上記にテンプレート、プライマーを加え、水で全量を20ulにします。
（10ul系で反応させる場合はそれぞれを半量にします。）

※当然、希釈しすぎると反応しなくなります。
サンプルによっても反応効率は違うのでほどほどに希釈して下さい。

dGTPを使う
伸長の難しいサンプルにはdGTPが有効です。
配列のパターンにより移動度が変わるため公式にはキャピラリーシーケンサーでの
使用は推奨されませんが機械にかけることはできます。
dGTP使用時、サンプルシートの設定はBigDye v3.1の設定を使用して下さい。

長所：二次構造をとってBigDyeでは伸長が止まってしまうものでも伸長する
短所：GとCが隣り合わせの配列部分が重なり合ってうまく読めない

なお、ABIの推奨ケミストリーは以下のようになっています。
ロングリード ..... BigDye v3.1
ショートフラグメント ..... BigDye v1.1
GT-rich ..... dGTP
G-rich ..... dGTP
GC-rich ..... BigDye v3.1
C-rich ..... BigDye v3.1
二次構造 ..... dGTP

＜受託シーケンスをご利用の方へ＞

データをメールで送付希望の方への注意事項

メールの送信に特殊な方法を使用していないため
s.okayama-u.ac.jpやgmail.comを使われている方は
迷惑メールに入ることが多いようです。
結果の到着が遅い場合、迷惑メールを確認して
届いてない場合はご連絡下さい。

結果は全ての波形データ(ab1ファイル)と配列テキストデータ(txtファイル)をzip圧縮で
１つにまとめた形で送付します。

通常はメール添付で送信しますが、添付サイズが大きい場合、ダウンロードの方法をとります。
その場合、セキュリティはありませんので大量依頼時はなるべくCDRを使うようにしてください。

まれに担当者がシーケンスできないときは代理を頼むことがありますが、
そのときはメール送信できません。ご注意ください。